Cromatografia é um dos métodos de separação de substâncias. É usado para análises qualitativas e quantitativas subsequentes das propriedades físicas e químicas das micropartículas. Uma variação desta tecnologia é a cromatografia de afinidade. A ideia de diferenciar compostos proteicos usando a propriedade de afinidade molecular é conhecida na ciência há várias décadas. No entanto, recebeu seu desenvolvimento apenas nos últimos anos, após a introdução de materiais hidrofílicos altamente porosos utilizados como matriz. Este método permite resolver tanto problemas analíticos (separação de substâncias e sua identificação) como problemas preparativos (purificação, concentração).
Essência
A cromatografia de afinidade (da palavra latina affinis - “adjacente”, “relacionado”) é baseada em interações de afinidade, que são a formação de ligações altamente específicas entre uma molécula espaçadora (ligante ou afinante) e uma molécula alvo. Esses mecanismos são de natureza generalizada (conexão de mediadores ou hormônios e receptores, anticorpos eantígenos, hibridização de polinucleotídeos e outros tipos de processos). Na medicina, a cromatografia de afinidade tem sido usada para fins práticos desde 1951
Os componentes são separados da seguinte forma:
- solução de trabalho contendo a substância a ser isolada é passada pelo sorvente;
- ligante depositado na matriz sorvente retém esta substância;
- é concentrado (acumulação);
- extração da substância isolada do sorvente por lavagem com solvente.
Este método permite isolar células inteiras. A diferença da cromatografia de sorção tradicional é que há uma forte ligação bioespecífica do componente isolado ao sorvente, que é caracterizada por alta seletividade.
Adsorventes
As seguintes substâncias são usadas como adsorventes:
- Compostos em gel à base de agarose, um polissacarídeo obtido do ágar. As mais utilizadas são 3 variedades: sepharose 4B, CL (agarose reticulada) e affi-gel. A última composição é um gel modificado de agarose e poliacrilamida. Possui maior inércia biológica, alta resistência química e térmica.
- Sílica (gel de sílica).
- Copo.
- Polímeros orgânicos.
Para eliminar obstáculos mecânicos durante o contato com o ligante, substâncias adicionais são usadas para separá-lo do carreador (peptídeos, diaminas, poliaminas, oligossacarídeos).
Equipamento
Equipamento de cromatografia de afinidade inclui as seguintes unidades principais:
- tanques de armazenamento para a fase móvel (eluente);
- bombas de alta pressão para fornecimento médio (na maioria das vezes alternativas);
- filtro para limpar eluentes do pó;
- dispositivo de dosagem;
- coluna cromatográfica para separação de misturas;
- detector para detectar componentes separados que saem da coluna;
- gravadores de cromatograma e unidade de microprocessador (computador).
Para reduzir a quantidade de ar dissolvido, o hélio passa primeiro pela fase móvel. Para alterar a concentração do eluente, são instaladas várias bombas controladas pelo programador. As colunas cromatográficas são feitas de aço inoxidável (para maiores requisitos de resistência à corrosão), vidro (opção universal) ou acrílico. Para fins preparativos, seu diâmetro pode variar de 2 a 70 cm. Na cromatografia analítica, são utilizadas microcolunas Ø10-150 µm.
Para aumentar a sensibilidade dos detectores, são introduzidos reagentes na mistura, que contribuem para a formação de substâncias que absorvem mais raios na região ultravioleta ou visível do espectro.
Metodologia
Existem 2 tipos principais de cromatografia de afinidade líquida:
- Coluna, na qual a coluna é preenchida com uma fase estacionária e uma mistura passa por ela com um fluxoeluente. A separação pode ocorrer sob pressão ou gravidade.
- Camada fina. O eluente se move ao longo da camada adsorvente plana sob a influência de forças capilares. O adsorvente é aplicado em uma placa de vidro, cerâmica ou bastão de quartzo, folha de metal.
Os principais estágios do trabalho incluem:
- preparação do adsorvente, fixação do ligante no carreador;
- alimentação da mistura de separação na coluna cromatográfica;
- carregamento de fase móvel, ligação de componente por ligante;
- substituição de fase para isolar a substância ligada.
Destino
A cromatografia de afinidade é usada para isolar os seguintes tipos de substâncias (o tipo de ligante usado é indicado entre parênteses):
- análogos de inibidores enzimáticos, substratos e cofatores (enzimas);
- substâncias bioorgânicas com sinais de alienação genética, vírus e células (anticorpos);
- carboidratos de alto peso molecular, polímeros de monossacarídeos, glicoproteínas (lectinas);
- proteínas nucleares, nucleotidiltransferases (ácidos nucleicos);
- receptores, proteínas de transporte (vitaminas, hormônios);
- proteínas interagindo com membranas celulares (células).
Essa tecnologia também é usada para obter enzimas imobilizadas, e sua ligação à celulose permite a produção de imunossorventes.
Cromatografia de proteínas de ligação ao DNA
O isolamento de proteínas de ligação ao DNA é realizado usandoheparina. Este glicosaminoglicano é capaz de se ligar a uma ampla gama de moléculas. A cromatografia de afinidade de proteínas deste grupo é usada para isolar substâncias como:
- fatores de iniciação e alongamento da tradução (síntese de moléculas de ácido nucleico e proteínas);
- restrictases (enzimas que reconhecem certas sequências no DNA de fita dupla);
- DNA ligases e polimerases (enzimas que catalisam a união de duas moléculas para formar uma nova ligação química e estão envolvidas na replicação do DNA);
- inibidores de serina protease que desempenham um papel importante nos processos imunológicos e inflamatórios;
- fatores de crescimento: fibroblasto, Schwann, endotelial;
- proteínas da matriz extracelular;
- receptores hormonais;
- lipoproteínas.
Dignidade
Este método é um dos mais específicos para o isolamento de compostos reativos (enzimas e agregados maiores - vírus). No entanto, não é usado apenas para isolar substâncias biologicamente ativas.
Detecção de anticorpos em pequenas quantidades, avaliação quantitativa do ácido poliadenílico, determinação rápida das massas moleculares das desidrogenases, remoção de certos poluentes, estudo da cinética de ativação da forma inativa da tripsina, estrutura molecular da tripsina humana interferons - esta não é toda a lista de estudos em que a afinidade é usada. A utilização na clínica deve-se às suas vantagens como:
- Capacidade de limpeza eficazproteínas, polissacarídeos, ácidos nucleicos. Eles diferem ligeiramente em suas propriedades físicas e químicas e perdem atividade durante a hidrólise, desnaturação e outros tipos de tratamento usados em outros métodos.
- A velocidade de separação das substâncias, a natureza dinâmica do processo.
- Não há necessidade de purificação especial de enzimas e homogeneização de isoenzimas para determinar constantes de dissociação.
- Capaz de separar uma ampla gama de substâncias.
- Baixo consumo de ligantes.
- Possibilidade de separação de substâncias em grandes volumes.
- Processo reversível de ligação de macromoléculas biológicas.
Esta técnica pode ser combinada com outras, para impor um campo adicional (gravitacional, eletromagnético). Isso permite expandir as capacidades técnicas da cromatografia.
Engenharia enzimática
Graças a este método, iniciou-se o desenvolvimento ativo de um novo ramo da biotecnologia - engenharia enzimática.
A cromatografia de afinidade para isolamento de enzimas tem as seguintes vantagens:
- obtenção de enzimas em grandes quantidades como resultado de menos tempo, como resultado - sua redução no preço;
- a imobilização de enzimas pode expandir significativamente o escopo de sua aplicação na medicina e na indústria;
- A associação de enzimas com um suporte sólido insolúvel permite estudar a influência do microambiente e a direção das reações, que desempenham um papel importante nos processos naturais e fisiológicos.
