DNA recombinante são moléculas formadas por técnicas laboratoriais de recombinação genética para combinar material genético de múltiplas fontes. Isso é possível porque as moléculas de DNA de todos os organismos têm a mesma estrutura química e diferem apenas na sequência de nucleotídeos dentro dela.
Criação
Clonagem molecular é um processo de laboratório usado para criar DNA recombinante. É um dos dois métodos mais utilizados, juntamente com a reação em cadeia da polimerase (PCR). Ele permite que você controle a replicação de qualquer sequência de DNA específica escolhida pelo experimentador.
Existem duas diferenças fundamentais entre os métodos de DNA recombinante. Uma é que a clonagem molecular envolve a replicação em uma célula viva, enquanto a PCR envolve in vitro. Outra diferença é que o primeiro método permite recortar e colar sequências de DNA, enquanto o segundo é aprimorado copiando a ordem existente.
DNA Vetorial
A obtenção de DNA recombinante requer um vetor de clonagem. É derivado de plasmídeos ou vírus e é um segmento relativamente pequeno. A escolha do vetor para clonagem molecular depende da escolha do organismo hospedeiro, do tamanho do DNA a ser clonado e se as moléculas estranhas devem ser expressas. Os segmentos podem ser combinados usando vários métodos, como clonagem de enzima de restrição/ligase ou montagem de Gibson.
Clonagem
Em protocolos padrão, a clonagem envolve sete etapas.
- Selecione o organismo hospedeiro e o vetor de clonagem.
- Obtenção de um vetor de DNA.
- Formação de DNA clonado.
- Criação de DNA recombinante.
- Introduzindo-o no organismo hospedeiro.
- Seleção de organismos que o contém.
- Seleção de clones com inserções de DNA e propriedades biológicas desejadas.
Após o transplante no organismo hospedeiro, as moléculas estranhas contidas no construto recombinante podem ou não ser expressas. A expressão requer a reestruturação do gene para incluir sequências que são necessárias para a produção de DNA. Ele está sendo usado pela máquina de tradução do host.
Como funciona
DNA recombinante funciona quando a célula hospedeira expressa uma proteína de genes recombinantes. A expressão depende de envolver o gene com um conjunto de sinais que fornecem instruções para sua transcrição. Eles incluem promotor, ligação de ribossomo e terminador.
Problemas surgem se o genecontém íntrons ou sinais que atuam como terminadores para o hospedeiro bacteriano. Isso leva ao término prematuro. A proteína recombinante pode ser inadequadamente processada, dobrada ou degradada. Sua produção em sistemas eucarióticos geralmente ocorre em leveduras e fungos filamentosos. O uso de gaiolas para animais é difícil devido à necessidade de uma forte superfície de apoio para muitos.
Propriedades dos organismos
Organismos contendo moléculas de DNA recombinante têm fenótipos aparentemente normais. Sua aparência, comportamento e metabolismo geralmente não mudam. A única maneira de demonstrar a presença de sequências recombinantes é examinar o próprio DNA usando o teste de reação em cadeia da polimerase.
Em alguns casos, o DNA recombinante pode ter efeitos nocivos. Isso pode acontecer quando seu fragmento contendo um promotor ativo está localizado próximo a um gene da célula hospedeira anteriormente silenciosa.
Usar
A tecnologia de DNA recombinante é amplamente utilizada em biotecnologia, medicina e pesquisa. Suas proteínas e outros produtos podem ser encontrados em quase todas as farmácias ocidentais, clínicas veterinárias, consultórios médicos, laboratórios médicos ou biológicos.
A aplicação mais comum é na pesquisa básica, onde a tecnologia é essencial para grande parte do trabalho atual nas ciências biológicas e biomédicas. O DNA recombinante é usado para identificar, mapear e sequenciar genes e determiná-losfunções. As sondas de rDNA são usadas para analisar a expressão gênica em células individuais e em tecidos de organismos inteiros. As proteínas recombinantes são usadas como reagentes em experimentos de laboratório. Alguns exemplos específicos são dados abaixo.
Quimosina recombinante
Encontrada no abomaso, a quimosina é uma enzima necessária para fazer queijo. Foi o primeiro aditivo alimentar geneticamente modificado utilizado na indústria. Uma enzima recombinante produzida microbiologicamente, estruturalmente idêntica a uma enzima derivada de bezerro, é mais barata e produzida em maiores quantidades.
Insulina humana recombinante
Insulina virtualmente substituída de origem animal (por exemplo, suínos e bovinos) para o tratamento de diabetes insulino-dependente. A insulina recombinante é sintetizada pela introdução do gene da insulina humana em bactérias do gênero Eterichia ou levedura.
Hormônio do Crescimento
Prescrita para pacientes cuja glândula pituitária não produz hormônio de crescimento suficiente para apoiar o desenvolvimento normal. Antes que o hormônio de crescimento recombinante se tornasse disponível, ele era obtido da glândula pituitária de cadáveres. Essa prática insegura levou alguns pacientes a desenvolver a doença de Creutzfeldt-Jakob.
Fator de coagulação recombinante
Esta é uma proteína de coagulação do sangue que é administrada a pacientes com formas de hemofilia com distúrbios hemorrágicos. Eles são incapazes de produzirfator VIII em quantidades suficientes. Antes do desenvolvimento do fator VIII recombinante, a proteína era produzida processando grandes quantidades de sangue humano de vários doadores. Isso acarretava um risco muito alto de transmissão de doenças infecciosas.
Diagnóstico da infecção pelo HIV
Cada um dos três métodos amplamente utilizados para diagnosticar a infecção pelo HIV foi desenvolvido usando DNA recombinante. Um teste de anticorpos usa sua proteína. Ele detecta a presença de material genético do HIV usando a reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa. O desenvolvimento do teste foi viabilizado pela clonagem molecular e sequenciamento dos genomas do HIV.
