A citometria de fluxo é um método de pesquisa citológica usado para análise aprofundada das células. Sua vantagem é que permite estudar cada célula individualmente. Esse tipo de análise ajuda a avaliar diversos parâmetros em centenas de células em questão de segundos. Como resultado, a citofluorimetria é considerada um dos métodos de análise mais rápidos e precisos atualmente disponíveis para cientistas e clínicos.
Princípio
O princípio da citometria de fluxo é baseado na medição da dispersão da luz e luminescência (fluorescência) das células. A suspensão de células é passada como um fluxo em alta velocidade através da célula do citômetro, onde é irradiada com um laser. A chamada focalização hidrodinâmica também é realizada lá. Seu mecanismo é que o fluxo da célula com as partículas estudadas na saída flui para o jato externo, que tem maior velocidade. Como resultado, as partículas são alinhadas em uma cadeia ordenada.
As pré-células são marcadas com corantes fluorescentes especiais (fluorocromos). Graças a eles, o raio laserexcita um brilho secundário. Os sinais de luz recebidos são registrados por detectores. Posteriormente, as informações são processadas usando algoritmos de software que permitem contar populações de células individuais que diferem em alguns critérios.
Pesquisas com microscopia convencional muitas vezes não conseguem distinguir entre células diferentes porque elas parecem iguais. A citofluorimetria pode fornecer outros dados (integridade da estrutura do DNA), analisar a expressão de proteínas, sobrevivência celular.
Como a excitação de fluorocromos requer feixes de luz com diferentes comprimentos de onda, bem como diferentes tipos de detectores, as instalações modernas estão equipadas com vários canais de detecção (de 4 a 30). O número de emissores de laser pode ser de 1 a 7. Dispositivos mais complexos permitem estudos multiparâmetros de várias propriedades de partículas de uma só vez.
Vantagens e desvantagens
Os benefícios da citometria de fluxo incluem:
- alta velocidade de processamento (registro de até 30 mil eventos em 1 segundo);
- possibilidade de estudar um grande número de células (até 100 milhões em uma amostra);
- Quantificação da intensidade da luz fluorescente;
- análise de cada célula;
- estudo simultâneo de processos heterogêneos;
- separação automática de dados por populações de células;
- visualização de resultados de qualidade.
Outra característica desta tecnologia é quea partícula analisada pode ser corada com várias soluções fluorescentes. Graças a isso, ocorre um estudo multiparâmetros.
As desvantagens incluem a complexidade do equipamento técnico e a necessidade de preparação especial da amostra.
Citômetros
Os primeiros aparelhos deste tipo apareceram já em 1968 na Alemanha, mas difundiram-se muito mais tarde. Atualmente, todos os aparelhos que funcionam pelo método de citometria de fluxo podem ser divididos em 2 tipos:
- dispositivos que medem radiação fluorescente (dois ou mais comprimentos de onda), espalhamento de luz de 10° e 90° (detector de ângulo baixo e espalhamento lateral);
- dispositivos que, além de medir vários parâmetros celulares, classificam automaticamente em grupos de acordo com esses critérios.
O detector de dispersão direta é projetado para determinar o tamanho da célula, e o dispositivo de dispersão lateral permite obter informações sobre a presença de grânulos intracelulares, a proporção de volume do citoplasma e do núcleo.
Os citômetros clássicos, ao contrário dos microscópios de luz, não permitem obter a imagem de uma célula. No entanto, nos últimos anos, foram desenvolvidos dispositivos combinados capazes de combinar as capacidades de um microscópio e um citofluorímetro. Eles serão discutidos abaixo.
Citômetros de imagem
Para instrumentos usados em citometria de fluxo clássica,uma característica é característica: se eventos raros são registrados na população de células analisadas, então não há como avaliar qual é a sua essência. Essas partículas podem ser restos de células mortas ou um grupo raro delas. Em dispositivos convencionais, tais dados são excluídos do fluxo geral de eventos, mas são eles que podem ser de particular valor para análises científicas e clínicas.
A nova geração de citômetros de fluxo de imagem permite capturar uma imagem de cada célula que passa no fluxo através da zona do detector. É fácil visualizá-lo clicando na área correspondente do diagrama, que é exibida no monitor do computador.
Áreas de aplicação
A citometria de fluxo é um método universal usado em muitos campos da medicina e da ciência:
- imunologia;
- oncologia;
- transplantologia (transplante de medula óssea vermelha, células-tronco);
- hematologia;
- toxicologia;
- bioquímica (medição da acidez dentro da célula, estudo de outros parâmetros);
- farmacologia (criação de novos medicamentos);
- microbiologia;
- parasitologia e virologia;
- oceanologia (o estudo do fitoplâncton para avaliar o estado dos corpos d'água e outras tarefas);
- nanotecnologia e análise de micropartículas.
Imunologia
O sistema imunológico humano consiste em uma grande variedade de células. A citometria de fluxo em imunologia permite avaliar sua estrutura e funções, ou seja, realizaranálise.
Tais pesquisas ajudam a entender a natureza complexa da imunidade. Os fenótipos celulares mudam como resultado da ativação por antígenos, desenvolvimento de patologias e outros fatores. A citofluorometria pode separar subpopulações de células imunes em uma mistura complexa e avaliar todas as suas mudanças ao longo do tempo.
Oncologia
Uma das tarefas mais importantes em oncologia é a diferenciação das células de acordo com seu tipo. O princípio da análise por citometria de fluxo em oncohematologia é baseado no seguinte fenômeno: quando uma amostra é tratada com um corante fluorescente especial, ela se liga a proteínas citoplasmáticas. Após a divisão em células em proliferação ativa, seu conteúdo diminui pela metade. Assim, a intensidade da luminescência da célula diminui duas vezes.
Existem outras maneiras de detectar células em proliferação:
- uso de corantes de ligação ao DNA (iodeto de propídio);
- uso de uracil rotulado;
- registro de um aumento do nível de expressão de proteínas ciclinas, que estão envolvidas na regulação do ciclo celular.
