PCR, ou reação em cadeia da polimerase, é uma técnica laboratorial sofisticada amplamente utilizada na medicina e em outros campos científicos. O diagnóstico de PCR tornou-se um verdadeiro avanço na ciência.
Descrição
PCR quantitativa é um tipo de PCR em tempo real.
Isto é entendido como uma variante da PCR, na qual a cinética da reação é constantemente registrada, o que permite avaliar qualitativamente o conteúdo de sequências nucleotídicas específicas de DNA em uma mistura molecular complexa.
O método PCR quantitativo será discutido em mais detalhes abaixo.
A essência da análise
Métodos culturais e sorológicos são especialmente usados para diagnosticar infecções. Sob o primeiro, os anticorpos para um patógeno infeccioso no soro sanguíneo são determinados. Na segunda, o material biológico retirado de uma pessoa doente é utilizado para semear um meio específico que seja favorável ao crescimento de colônias de patógenos. Diagnóstico em amboscaso pode durar dias ou semanas.
O exame de PCR pode ser realizado com diferentes materiais biológicos obtidos de uma pessoa doente. Sangue e outros meios e fluidos patológicos, fisiológicos e biológicos atuam como amostras. Você pode fazer PCR de fezes ou urina.
Infecções atípicas e virais são mais frequentemente diagnosticadas por PCR quantitativa, pois podem não ser fáceis de diagnosticar devido à natureza específica do processo patológico por elas provocado. Para determinar tais infecções, leva tempo, durante o qual os anticorpos começam a ser produzidos no corpo, determinados por métodos sorológicos. Mas isso é inaceitável em alguns casos.
Método de realização
Método de PCR - detecção laboratorial de infecção em amostras isoladas do paciente (in vitro).
Para realizar uma reação em cadeia da polimerase, é necessário um conjunto de reagentes especiais.
O material de teste é introduzido em tubos de ensaio com reagentes. Os tubos de ensaio são colocados em um aparelho especial - um amplificador de PCR, projetado para amplificar (aumentar o número) dos fragmentos de RNA ou DNA desejados, o amplificador de PCR opera em modo cíclico. Em qualquer ciclo, se as amostras contêm a sequência de RNA ou DNA do patógeno, mais e mais cópias das partículas desses ácidos nucleicos se acumulam na solução. Você pode determinar a presença do patógeno e sua quantidade nas amostras.
Tipos de PCR
A análise qualitativa por PCR permite obter o seguinte resultado:
- negativo quando o patógeno de interesse não for encontrado nas amostras;
- positivo se forem encontradas sequências nas amostras que são características de um determinado patógeno.
Com um resultado de PCR positivo, podemos falar com 95% de precisão sobre a presença de uma infecção diagnosticada. Ao mesmo tempo, a precisão dos conjuntos de PCR usados para fins de diagnóstico atinge 100%.
Geralmente 5% dos resultados incorretos são determinados pelo fator humano. Por exemplo, violações da técnica de análise e armazenamento de reagentes podem reduzir significativamente a precisão do estudo.
PCR quantitativo define o conceito de carga viral. É possível determinar quantos conjuntos de DNA de patógeno estavam nas amostras retiradas do paciente.
A gravidade da infecção é diretamente proporcional ao aumento do seu número. Você também pode determinar o sucesso da terapia para reduzir a carga viral.
Submissão para biomaterial de PCR
A PCR quantitativa é realizada na clínica, principalmente no período da manhã. Durante uma visita ao médico, o paciente será informado do que precisa ser tomado: raspagem, esfregaços, urina ou sangue. A PCR pode detectar patógenos independentemente do nível de contaminação do material.
Para uma análise positiva, teoricamente, é necessária a presença de apenas um patógeno nas amostras. Na prática, eles tentam criar condições ainda mais favoráveis. Existem algumas recomendações para isso:
- se eles tirarem uma raspagem ou cotonete dos órgãos genitaisórgãos, você precisa se abster de relações íntimas três dias antes do estudo;
- você não pode fazer ducha com drogas antibacterianas ou se lavar antes da análise;
- três horas antes de fazer um esfregaço da uretra, você precisa ser paciente e não esvaziar o intestino.
Não siga estas regras ao doar sangue.
Como os resultados da análise quantitativa de PCR são interpretados?
Avaliação quantitativa dos resultados obtidos
Em diversas situações clínicas, surge o problema da eficácia do tratamento e/ou da dinâmica do processo patológico. Tais questões são especialmente relevantes ao examinar pessoas com infecções crônicas (vírus da imunodeficiência humana, hepatite B e C). No diagnóstico, baseiam-se no fato de que o acúmulo de amplicons (produtos de PCR) é proporcional à presença de cópias do gene desejado na amostra analisada.
Claro, levando em consideração os resultados da PCR quantitativa é feita por eletroforese em gel com o estudo da intensidade dos sinais especiais de PCR. Além disso, um pré-requisito para uma avaliação quantitativa correta dos resultados obtidos são amostras de controle positivas e confiáveis contendo um número conhecido de cópias do gene desejado (por exemplo, mil cópias do gene da hepatite C para uma reação de PCR). Várias diluições em série do controle quantitativo permitem a geração de curvas de calibração e são usadas para avaliar o conteúdo de genocópias clínicas em amostras clínicas.
Na definição de PCR quantitativa, uma conquista fundamental foi a criaçãosondas de DNA fluorescentes que são adicionadas à mistura de reação simultaneamente com primers simples e permitem rastrear o processo de PCR a tempo, ou seja, PCR em tempo real.
A metodologia TaqMan refere-se à síntese de sondas de DNA fluorescentes que são específicas para a parte central do amplicon e possuem dois marcadores nas extremidades. Um deles é um marcador fluorescente, o segundo é uma molécula supressora para essa fluorescência.
Um dispositivo especial, que é um híbrido de um fluorímetro e um amplificador termobloco, faz medições constantes de fluorescência em cada tubo de ensaio (princípio de PCR em tempo real). Após 20-40 ciclos de PCR, curvas individuais serão obtidas para cada amostra. O número de cópias do gene desejado contido na amostra de teste pode ser calculado a partir de curvas de calibração com amostras de controle.
Além disso, uma característica importante da implementação da PCR pelo método fluorescente é que não há necessidade de abrir tubos com uma mistura de PCR ao levar em conta os resultados. Isso reduz a possibilidade de contaminação da sala com produtos de amplificação e não há necessidade de alocar áreas de trabalho especiais para eletroforese.
O que uma transcrição de PCR quantitativa mostra?
O que está sendo descoberto?
Através de um método como a PCR quantitativa, são encontradas alterações qualitativas nos genes: inserções, deleções e mutações pontuais. Mas com alguns distúrbios hereditários, os sintomas correspondentes aparecem em resposta a uma mudança no conteúdo de certos genes.
ObrigadoA análise quantitativa dá um resultado numérico, na maioria das vezes em UI/ml. Isso significa que em um mililitro da amostra de teste, foi encontrado um certo número de cópias do RNA ou DNA do patógeno, medido em unidades internacionais.
Dependendo da magnitude, a gravidade da infecção é diagnosticada. O sangue geralmente é testado para determinar a carga viral, pois os vírus se movem livremente no sangue durante a doença.
Recursos
PCR quantitativa em um exame de sangue tem duas características.
- A análise é realizada na presença de primers ou trifosfatos de desoxirribonucleosídeos, que são marcados com um marcador fluorescente ou radioativo para determinar com precisão o conteúdo do produto de PCR formado.
- No processo de PCR, termine a reação antes que apareçam muitos produtos de PCR. Isso se deve ao fato de que no estágio final de saturação, quando há muitos produtos da PCR, tanto a própria enzima quanto os substratos atuam como elos limitantes dessa reação. O final do próximo ciclo de PCR sob tais condições não é mais caracterizado por uma duplicação do número de produtos de PCR, diferenças quantitativas insignificantes entre diferentes amostras são niveladas, que são claramente definidas nos estágios iniciais após passar por uma série de ciclos de reação.
Custo do diagnóstico de PCR
Pesquisa de PCR tem um custo, que depende do tipo de infecção que será testada, da metodologia de análise e do material de teste. Para determinar uma infecção, você terá que dar dentro de200-800 rublos. Uma taxa para levar biomaterial também é adicionada - aproximadamente 400 rublos.
